B. BIOMARQUEURS SPECIFIQUES

Les indicateurs biologiques spécifiques ont été découverts il y a une vingtaine d'années, avec la mise en évidence chez les êtres vivants de systèmes - enzymatiques pour la plupart - spécialisés dans des fonctions de détoxication de l'organisme. Il s'agit de dispositifs de défense dont l'activité est rapidement induite par la présence d'un substrat particulier ou de composés possédant une conformation voisine. La mise en évidence de ces biomarqueurs donne une information relativement précise sur la nature du toxique qui les a induit, directement liée à l'état de stress observé chez l'individu.
Plusieurs systèmes, parmi ceux à l'étude chez les organismes marins comme indicateurs possibles d'intoxication, font l'objet de tentatives d'applications courantes. Nous citerons ici :

  • les activités éthoxyrésorufine O-dééthylase (EROD) et glutathion S-transférase (GST) pour ce qui est des dispositifs enzymatiques de détoxication ;

  • l'activité acétylcholinestérasique (AChE), qui n'entre pas dans le cadre de fonctions de détoxication, mais qui constitue la cible privilégiée de nombreuses contaminants neurotoxiques et dont l'inhibition constitue un excellent marqueur d'exposition aux polluants ;

  • la concentration des métallothionéines, protéines non-enzymatiques impliquées dans la régulation des métaux circulant dans l'organisme.
a) Activité éthoxyrésorufine O-dééthylase (EROD)

Un bon nombre de composés organiques nocifs présentent un caractère lipophile qui leur permet de s'accumuler au sein des réserves lipidiques des organismes et dans les membranes cellulaires (essentiellement constituées de phospholipides). La présence de telles molécules entraîne rapidement la mise en route des systèmes biochimiques de détoxication dont le rôle est de rendre hydrosolubles ces composés dangereux, afin de faciliter leur excrétion par voie rénale, biliaire ou branchiale.
Certains organes du corps contiennent donc des enzymes chargées de catalyser une série de réactions permettant de détoxiquer à la fois des drogues et des composés nocifs présents dans l'organisme. La plus étudiée de ces réactions de détoxication est catalysée par une famille d'enzymes appelées cytochromes P450 (Cf. encadré).

Chez les poissons, le taux d'induction de cytochromes P450 de la famille 1A dans le foie est utilisé comme indice principal d'exposition des organismes à des polluants de type hydrocarbures aromatiques polycycliques (ou HAP, notamment le benzo[a]pyrène, Fig. 4) et polychloro-biphényles plans (PCB).
Fig. 4 : le benzo[a]pyrène, polluant d'origine ubiquiste, excellent inducteur très représentatif des hydrocarbures aromatiques polycycliques présents dans l'environnement marin.

La source majeure de contamination par les HAP est la combustion. Bien qu'il existe des sources naturelles de HAP (incendies de forêts), leur origine dans l'environnement est essentiellement humaine : utilisation de bois, charbon et fuel dans les chaufferies, d'essence dans les moteurs à combustion interne, ainsi que l'incinération des ordures.
Les propriétés physiques des PCB (stables thermiquement, résistants aux acides et aux bases, non-inflammables) font qu'ils sont largement utilisés : comme fluides caloporteurs dans les échangeurs thermiques, comme diélectriques dans les condensateurs, comme diluants organiques dans les plastiques et les encres, et dans la préparation de certains insecticides.
Notons encore l'existence d'autres inducteurs des cytochromes P450 1A, tels que les polychloro-dibenzodioxines (PCDD) et polychloro-dibenzofurannes (PCDF), utilisés notamment dans l'industrie de la pâte à papier et le raffinage des métaux, ainsi que les polychloro-azobenzènes (PCAB), qui interviennent dans certaines préparations commerciales d'insecticides (Namour, 1992).

Le protocole de mesure de l'activité EROD (Burke & Mayer, 1974) consiste à fournir à cette enzyme un substrat, l'éthoxyrésorufine, dont la réaction catalysée de dééthylation (c'est à dire la perte d'un groupement éthyle CH3-CH2-, d'ou l'appellation d'activité "dééthylase") libère de la résorufine (ou hydroxyrésorufine), molécule qui possède la propriété naturelle de fluorescence. Il est possible de quantifier cette fluorescence au moyen d'un appareillage adéquat (spectrofluorimètre) et l'intensité de la fluorescence mesurée est directement proportionnelle à la quantité de résorufine formée, elle-même corrélée à la quantité d'enzymes actives lors de la mesure.
L'efficacité de cette méthode pour mesurer les effets biologiques in situ de polluants d'importance aussi grande que les hydrocarbures dans le milieu marin a été confirmée au point qu'elle est aujourd'hui intégrée en routine dans les programmes de biosurveillance du R.N.O (Galgani et coll., 1992).

En savoir plus sur les cytochromes P450

C'est en 1958 que Klingerberg a signalé l'existence, chez le rat, d'un pigment dans le réticulum endoplasmique hépatique qui, complexé avec du monoxyde de carbone et à l'état réduit, absorbait fortement la lumière dans le bleu à 450 nm, d'où le nom de cytochrome P450 ("P" pour pigment).

Les systèmes à cytochromes P450 sont ubiquistes. On en trouve chez les procaryotes et les levures jusqu'aux plantes supérieures et aux Mammifères, en passant par les Champignons, les Insectes, les Mollusques, les Poissons (des Agnathes aux Téléostéens), les Reptiles et les Oiseaux. Aujourd'hui, on distingue au moins 13 familles de cytochromes P450, chaque famille regroupant des cytochromes ayant un pourcentage de similitudes compris entre 40 et 65%. Au moins 5 familles de P450 sont impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques : les familles 1, 2, 3, 5 et 6.
Les enzymes à cytochrome P450 sont généralement localisées dans le réticulum endoplasmique lisse (animaux et végétaux) mais elles se trouvent aussi dans les membranes internes des mitochondries (Mammifères et Insectes) ou dans l'enveloppe nucléaire (animaux seulement). On connaît même des formes solubles chez les bactéries. La répartition des enzymes à P450 des animaux se localise essentiellement au niveau du foie, du poumon, des reins et des glandes surrénales.

Un système à cytochrome P450 est en réalité un complexe multienzymatique formé de :
  • 2 flavoprotéines, formant 2 chaînes de transporteurs d'électrons : la NADPH cytochrome P450 réductase et la NADH cytochrome b5 réductase.

  • 2 hémoprotéines, le cytochrome b5 et le cytochrome P450. Ce dernier constitue une famille d'hémoprotéines de masse moléculaire comprise entre 43 et 60 kDa, possédant un noyau tétrapyrollique qui complexe un atome de fer pouvant passer de l'état ferreux (Fe2+) à l'état ferrique (Fe3+) de manière réversible, ce qui confère des propriétés d'oxydo-réduction au cytochrome P450.

Le dénominateur commun de toutes les réactions auxquelles participent les P450 est l'insertion d'un atome d'oxygène sur un substrat par réduction d'une molécule d'oxygène moléculaire dissous. La séquence catalytique comprend les étapes suivantes (Fe représente l'atome de l'hème du site actif et RH le substrat) :


1. Fixation du substrat sur le site catalytique.

2. Réduction des 2 flavines de la NADPH cytochrome P450 réductase par le NADPH,H+ et transfert d'un électron au cytochrome P450.

3. Fixation d'une molécule d'oxygène pour donner un complexe cytochrome P450 dioxygéné ferreux.

4. Transfert d'un second électron par la NADPH cytochrome P450 réductase, ou le cytochrome b5, au complexe dioxygéné.

5. Rupture de la liaison oxygène-oxygène avec incorporation d'un atome d'oxygène dans une molécule d'eau.

6. Activation du substrat.

7. Transfert du second atome d'oxygène au substrat.

8. Dissociation et libération du produit.

 REFERENCES

BURKE M.D., MAYER R.T. (1974). Ethoxyresorufin : direct fluorimetric assay of microsomal O-dealkylation whichis preferentially inducible by 3-methylcholanthrene. Drug. Metab. Disp., 2 : 583-588. [retour texte]

GALGANI F., HENOCQUE Y., LAFAURIE M. (1992). Surveillance des effets biochimiques des polluants sur les organismes marins le long des côtes de France. "Qualité du milieu marin - Indicateurs biologiques et physico-chimiques", Boudouresque C.F., Avon M. & Pergent-Martini C. edit., GIS Posidonie publ., Fr, pp. 59-71. [retour texte]

KLINGERBERG M. (1958). Pigments of rats liver microsomes. Arch. Biochem. Biophys., 75 : 376-386. [retour texte]

NAMOUR P. (1992). Les mono-oxygénases de poissons, un outil pour la caractérisation des pollutions chroniques. Etudes du CEMAGREF, série Ressources en Eau, n° 6, 232 p. [retour texte]